細(xì)胞培養(yǎng)常見問題的原因及對策
細(xì)胞培養(yǎng)常見問題的原因及對策
1. 培養(yǎng)液pH值變化太快：
CO2張力不對。培養(yǎng)瓶蓋擰得太緊。NaHCO3緩沖系統(tǒng)緩沖力不足。培養(yǎng)液中鹽濃度不正確。**、酵母或**污染。
按培養(yǎng)液中NaHCO3濃度增加或減少培養(yǎng)箱內(nèi)CO2濃度，2.0g/L到3.7g/L濃度NaHCO3對應(yīng)CO2濃度為5％到10％。（2）改用不依賴CO2培養(yǎng)液。
松開瓶蓋1/4圈。
加HEPES緩沖液至10到25mM終濃度。
在CO2培養(yǎng)環(huán)境中改用基于Earle’s鹽配制的培養(yǎng)液，在大氣培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)改用Hank’s鹽配制的培養(yǎng)液。
丟棄培養(yǎng)物或用*****。
2. 培養(yǎng)液出現(xiàn)沉淀，但pH值不變：
用洗滌劑清洗后殘留磷酸鹽將培養(yǎng)基成分沉淀下來。冰凍保存培養(yǎng)液。
用去離子水反復(fù)沖洗玻璃器皿，然后**。
將培養(yǎng)液加熱到37℃，搖動使其溶解如沉淀仍然存在，丟棄培養(yǎng)液。
3. 培養(yǎng)液出現(xiàn)沉淀，同時pH 發(fā)生變化：
**或**污染。
丟棄培養(yǎng)物或用*****。
4. 培養(yǎng)細(xì)胞不貼壁：
胰蛋白酶消化過度；支原體污染；培養(yǎng)液中無貼壁因子。
縮短胰蛋白酶消化時間或降低胰蛋白酶濃度。
分離培養(yǎng)物，檢測支原體。清潔支架和培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物。
5. 懸浮細(xì)胞成簇：
培養(yǎng)液中含鈣、鎂離子。支原體污染。蛋白酶過度消化使得細(xì)胞裂解釋放DNA。
用無鈣鎂平衡鹽溶液洗滌細(xì)胞，輕輕吹吸細(xì)胞獲得單細(xì)胞懸液。
分離培養(yǎng)物，檢測支原體。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物。
用DNase I處理細(xì)胞。
6. 原代細(xì)胞培養(yǎng)物污染：
原代培養(yǎng)組織在進入培養(yǎng)前已污染
培養(yǎng)前用含高濃度***的平衡鹽溶液反復(fù)沖洗組織。
7. 培養(yǎng)細(xì)胞死亡：
培養(yǎng)箱內(nèi)無CO2。培養(yǎng)箱內(nèi)溫度波動太大。細(xì)胞凍存或復(fù)蘇過程中損傷。培養(yǎng)液滲透壓不正確。培養(yǎng)液種有毒代謝產(chǎn)物堆積。
檢測培養(yǎng)箱內(nèi)CO2
檢查培養(yǎng)箱內(nèi)溫度
取新的保存細(xì)胞種
檢測培養(yǎng)液滲透壓。注意：大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞能耐受滲透壓為260–350mOsm/kg。加入額外試劑如HEPES或**都有可能影響培養(yǎng)液滲透壓。
換入新鮮培養(yǎng)液
8. 培養(yǎng)細(xì)胞生長減慢：
由于更換不同培養(yǎng)液或血清。培養(yǎng)液中一些細(xì)胞生長必需成分如谷氨酰胺或生長因子耗盡或缺乏或已被破壞。培養(yǎng)物中有少量**或**污染。試劑保存不當(dāng)。
比較新培養(yǎng)液與原培養(yǎng)液成分，比較新血清與舊血清支持細(xì)胞生長實驗。
增加起始培養(yǎng)細(xì)胞濃度。
讓細(xì)胞逐漸適應(yīng)新培養(yǎng)液。
換入新鮮配制培養(yǎng)液。
補加谷氨酰胺或生長因子。
用無***培養(yǎng)液培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)污染，丟棄培養(yǎng)物。或用*****。
血清需保存在-5℃ 到-20℃。培養(yǎng)液需在2–8℃避光保存。含血清完全培養(yǎng)液在2–8℃保存，并在2周內(nèi)用完。
接種細(xì)胞起始濃度太低，細(xì)胞已老化，支原體污染。
增加接種細(xì)胞起始濃度。
換用新的保種細(xì)胞。
分離培養(yǎng)物，檢測支原體。清潔支架和培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物。
