細胞培養中的注意事項

細胞培養中的注意事項
1 冷凍管應如何解凍？
取出冷凍管后，須立即放入37C水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內全部融化，并注意水面不可超過冷凍管蓋沿，否則易發生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時，必須注意**，預防冷凍管之爆裂。
2 細胞冷凍管解凍培養時，是否應馬上去除DMSO？
除少數特別注明對DMSO敏感之細胞外，絕大部分細胞株（包括懸浮性細胞），在解凍之后，應直接放入含有10-15ml新鮮培養基之培養角瓶中，待隔天再置換新鮮培養基以去除DMSO即可，如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附之問題。
3 可否使用與原先培養條件不同之培養基？
不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應之細胞培養基，若驟然使用和原先提供之培養條件不同之培養基，細胞大都無法立即適應，造成細胞無法存活。
4 可否使用與原先培養條件不同之血清種類？
不能。血清是細胞培養上一個極為重要的營養來源，所以血清的種類和品質對于細胞的生長會產生極大的影響。來自不同物種的血清，在一些物質或分子的量或內容物上都有所不同，血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。
5 何謂FBS, FCS, CS, HS ?
FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum)是相同的意思，兩者都是指胎牛血清，FCS乃錯誤的使用字眼，請不要再使用。CS (calf serum) 則是指小牛血清。HS(horseserum)則是指馬血清。
6 培養細胞時應使用5 %或10% CO2？或根本沒有影響？
一般培養基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作為pH的緩沖系統，而培養基中NaHCO3的含量將決定細胞培養時應使用的CO2濃度。當培養基中NaHCO3含量為每公升3.7g時，細胞培養時應使用10% CO2；當培養基中NaHCO3為每公升1.5 g時，則應使用5%CO2培養細胞。
7 何時須更換培養基？
視細胞生長密度而定，或遵照細胞株基本數據上之更換時間，按時更換培養基即可。
8 培養基中是否須添加***？
除于特殊篩選系統中外，一般正常培養狀態下，培養基中不應添加任何***。
9附著性細胞繼代時所使用之trypsin-EDTA濃度？應如何處理？
一般使用之trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4Na。**次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中，保存于–20C，避免反復冷凍解凍造成trypsin之活性降低，并可減少污染之機會。
10 懸浮性細胞應如何繼代處理？
一般僅需持續加入新鮮培養基于原培養角瓶中，稀釋細胞濃度即可，若培養液太多時，可將培養角瓶口端稍微抬高，直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細胞之培養液至另一新的培養角瓶，加入新鮮培養基稀釋至適當濃度，重復前述步驟即可。
11 欲將一般動物細胞離心下來，其離心速率應為多少轉速？
欲回收動物細胞，其離心速率一般為300xg (約1,000rpm)，5 - 10分鐘，過高之轉速，將造成細胞死亡。

12 細胞之接種密度為何？
依照細胞株基本數據上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細胞數太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長之一重要原因。
13 細胞冷凍培養基之成份為何？
動物細胞冷凍保存時*常使用的冷凍培養基是含5 - 10% DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 -95%原來細胞生長用之新鮮培養基均勻混合之。注意：由于DMSO稀釋時會放出大量熱能，故不可將DMSO直接加入細胞液中，必須使用前先行配制完成。
14 DMSO之等級和無菌過濾之方式為何？
冷凍保存使用之DMSO等級，必須為Tissue culture grade之DMSO(如SigmaD2650)，其本身即為無菌狀況，**次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中，保存于4C，避免反復冷凍解凍造成DMSO之裂解而釋出有害物質，并可減少污染之機會。若要過濾DMSO，則須使用耐DMSO之Nylon材質濾膜。
15 冷凍保存細胞之方法？
冷凍保存方法一：冷凍管置于4 C 30~60分鐘 → (-20 C 30分鐘) → -80 C 16~18小時(或隔夜)→液氮槽vapor phase長期儲存。
冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3 C 至–80 C 以下，再放入液氮槽vaporphase長期儲存。*-20 C 不可超過1小時，以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80C冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
16 細胞欲冷凍保存時，細胞冷凍管內應有多少細胞濃度？
冷凍管內細胞數目一般為1x106 cells/ml vial，融合瘤細胞則以5x106 cells/mlvial為宜。
17 應如何避免細胞污染？
細胞污染的種類可分成**、酵母菌、霉菌、病毒和霉漿菌。主要的污染原因為無菌操作技術不當、操作室環境不佳、污染之血清和污染之細胞等。嚴格無菌操作技術、清潔的環境、與品質良好之細胞來源和培養基配制是減低污染之*好方法。
18 如果細胞發生微生物污染時，應如何處理？
加入相應***，直接**后丟棄之。
19 支原體(mycoplasma)污染的細胞，是否能以肉眼觀察出異狀？
不能。除極有經驗之專家外，大多數遭受支原體污染的細胞株，無法以其外觀分辨之。
20 支原體污染會對細胞培養有何影響？
支原體污染幾乎可影響所有細胞之生長參數，代謝及研究任一數據。故進行實驗前，必須確認細胞為mycoplasma-free，實驗結果之數據方有意義。
21 偵測出細胞株有支原體污染時， 該如何處理？
直接**后丟棄，以避免污染其它細胞株。
22 CO2培養箱之水盤如何保持清潔？
定期(至少每兩周一次) 以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。
23 為何培養基保存于4C冰箱中，顏色會偏暗紅色，且pH值會越來越偏堿性？
培養基保存于4 C 冰箱中，培養基內之CO2會逐漸溢出，造成培養基越來越偏堿性，而培養基中之酸堿指示劑(通常為phenolred)的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養基偏堿之結果，將造成細胞生長停滯或死亡。若培養基偏堿時，可以通入無菌過濾之CO2，以調整pH值。
24 各種細胞培養用的dish，flask是否均相同？
不同廠牌的dish或flask，其所coating的polymer不同，制造程序亦不同，雖對大部分細胞沒有太大之影響，惟少數細胞則可能因使用廠牌不同之dish或flask而有顯著之生長差異。
25購買之細胞冷凍管經解凍后，為何會發生細胞數目太少之情形？
研究人員在冷凍細胞之培養時出現細胞數目太少，大都是因為離心過程操作上的失誤，造成細胞的物理性損傷，以及細胞流失。建議細胞解凍后不要立刻離心，應待細胞生長隔夜后再更換培養基即可。
26 購買之細胞死亡或細胞存活率不佳可能原因？
研究人員在細胞培養時出現存活率不佳，常見原因可歸納為：培養基使用錯誤或培養基品質不佳。血清使用錯誤或血清的品質不佳。解凍過程錯誤。冷凍細胞解凍后，加以洗滌細胞和離心。懸浮細胞誤認為死細胞。培養溫度使用錯誤。細胞置于–80C太久。
27 收到之冷凍管瓶身破裂，瓶蓋有裂紋，或瓶蓋脫落之原因？
冷凍管瓶蓋裂紋，或瓶身破裂，可能是因為操作者夾取冷凍管時用力不當，造成冷凍管裂損，建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動或松脫，乃因熱脹冷縮之物理現象，冷凍管有可能因此而造成細胞污染，故冷凍管于放入和取出液氮桶時，均應立刻將冷凍管再一次扭緊。
28 如何選用特殊細胞系培養基？
培養某一類型細胞沒有固定的培養條件。在MEM中培養的細胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長。總之，優選MEM做粘附細胞培養、RPMI-1640做懸浮細胞培養是一個好的開始，各種目的無血清培養*好優選AIMV（12005）培養基（SFM）。
29 L-谷氨酰胺在細胞培養中重要嗎？它在溶液中不穩定嗎？
L-谷氨酰胺在細胞培養時是重要的。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養細胞的能量來源、參與蛋白質的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經過一段時間后會降解，但是確切的降解率一直沒有*終定論。L-谷氨酰胺的降解導致氨的形成，而氨對于一些細胞具有毒性。
30GlutaMAX-I是什么？培養細胞如何利用GlutaMAX-I？這個二肽有多穩定？
GlutaMAX-I二肽是一個L-谷氨酰胺的衍生物，其不穩定的alpha-氨基用L-丙氨酸來保護。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I二肽非常穩定，即使在121磅**20分鐘，GlutaMAX-I二肽溶液有*小的降解，如果在相同條件下，L-谷氨酰胺幾乎完全降解。
31 什么培養基中可以省去加酚紅？
酚紅在培養基中被用來作為PH值的指示劑：中性時為紅色，酸性時為黃色，堿性時為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類**的作用，（特別是雌**）。為避免固醇類反應，培養細胞，尤其是哺乳類細胞時，用不加酚紅的培養基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細胞檢測時，不使用加有酚紅的培養基。
32 培養基中丙酮酸鈉的作用是什么？
丙酮酸鈉可以作為細胞培養中的替代碳源，盡管細胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒有葡萄糖的話，細胞也可以代謝丙酮酸鈉。
33目錄上說，Hank’s平衡鹽溶液(HBS)要在空氣中使用，不需要CO2培養箱。原因是什么？Hank’s平衡鹽溶液(HBS)和Earle’s平衡鹽溶液(EBS)有什么本質的功能差別？
HBS和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平，在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks(0.35g/L)中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡，以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2中，溶液會變堿，Hanks液在CO2培養箱中會變酸。如果希望在CO2培養箱中保存組織，需要用Eagles液，。如果僅僅是清洗將要在細胞培養基中儲存的組織，用Hanks液就可以了。
34二價離子抑制胰蛋白酶活性嗎？使用胰蛋白酶時加入EDTA的目的是什么？
二價離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細胞前，用EDTA清洗細胞，以消除來自培養基中所有的二價離子。
35當在無血清培養基中添加***時，降低至少在有血清培養基中所使用濃度的50%。血清蛋白會結合和滅活一些***。在無血清培養條件下，***不被滅活，可能對于細胞達到毒性水平。
36一旦您在新鮮培養基中添加了血清和***時，您應該在兩到三周內使用它。因為一些***和血清中的基本成分在解凍后就開始降解。
37大部分添加物和試劑*多可以凍融3次，如果次數更多都會在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，將會影響它的性能。
38在溶解的一周內使用貯存在4℃冰箱中的液體胰蛋白酶溶液。胰蛋白酶在4℃就可能開始降解，如果在室溫下放置超過30分鐘，就會變得不穩定。