細胞養得好，習性掌握牢

這個不僅僅是說培養基的不同，還有就是細胞生長的空間密度問題。有一些細胞是數量多一點比較好生長，生長狀態也比較好。這種一般是屬于生長速度慢的細胞。譬如內皮細胞。而有一些是細胞是數量少一點細胞狀態會生長的比較好，譬如巨噬細胞和某些腫瘤細胞。尤其是巨噬細胞，生長速度非常得快，貼壁速度很快，所以傳代時就應該留很少量的細胞，這樣細胞狀態會比較好。并且巨噬細胞比較喜歡扎堆生長，而堆與堆之間是有空間的。如果長成相連在一起的一滿片的時候，細胞形態基本上就會差了，老化的會比較多，對后期實驗結果是不好的。所以在養細胞的時候應該摸索該細胞喜歡的生長空間密度問題。

這個其實是有一個方法可以改善的。對于貼壁細胞，如果細胞形態不好，（或者細胞形態不清晰，表面似有異物等）可以在傳代的時候進行如下操作：

首先，倒掉舊的培養基，加入3ml新的培養基（有無血清的都可）洗滌一次，用滴管吸走，然后再加入3ml的培養基，進行預吹打，控制吹打力度，輕輕地大概沿著瓶底過一遍，然后吸走。這時侯再開始正式的消化、吹打。（巨噬細胞建議只吹打，不消化）

其次，把吹打下來的細胞懸液加入到新的培養瓶內，培養瓶事先加入培養基，放入培養箱內培養，按時間點觀察細胞貼壁情況。10分鐘觀察一次，20分鐘，30分鐘觀察一次。選擇一個時間點，已經有部分細胞貼壁的情況下，重新置于潔凈臺，底面朝上迅速倒出其中的培養基，加入3ml新培養基再輕輕洗一次。然后加入完全培養基培養。后續觀察細胞生長情況以及形態。通常稱之為“二傳”。

如果一次效果還不理想，可重復多次。直到找到細胞**形態。其中要注意，結合細胞喜歡的生長情況。喜歡多一點數量長得好的細胞你就等貼壁細胞比較多點的時候再傳。反之亦然。

這個是要靠自己去摸索的。并不是小的玻璃方瓶5ml，大方瓶10ml的。有些細胞反而是培養基少一點相反細胞形態會長得比較好。（可能也是競爭很大，有優勝劣汰吧）。對于生長速度快的細胞，易生長的細胞加少一點培養基細胞形態會更好。但是要注意換液的掌握。

個人發現生長速度快的細胞在玻璃瓶內生長的狀態會比一次性塑料瓶相對好一些。而對于同一種細胞，在其生長旺盛快速的時期在玻璃瓶內的生長狀態也比塑料瓶內好。這可能是因為塑料瓶比玻璃瓶更容易貼壁。生長速度快的細胞在塑料瓶這種相對“更安逸”的環境里反而長得狀態不如玻璃瓶好。

所以對于生長速度慢的細胞如果想要更漂亮的細胞狀態，塑料瓶比玻璃瓶會好，對于生長速度快的細胞，玻璃瓶則會更好。同樣，對于同一種細胞，在其生長速度慢的時候，塑料瓶會好一點，比如剛剛復蘇的時候，或者原代培養的時候。而在其生長旺盛的時候，玻璃瓶則相對會好一點。

可以這樣說，對于需要消化傳代的細胞，每一次的消化都是對這個細胞存活與否，狀態好與不好*至關重要的考驗。

很多同學都遇到過這個問題，自己養的細胞開始的幾代長的還挺好的，可是穿過幾代之后就發現自己的細胞不行了，狀態越來越差勁了。對于這個問題，可以非常肯定地說，你的消化環節出問題了。你每一次的消化都讓細胞受到較大損傷了。所以，越長越差。

在消化的過程中，你加入胰酶后，所有細胞都在被胰酶消化著，但是我們忽視了一個問題就是，細胞的生長狀態是不一樣的，每一個細胞的貼壁情況也是不一樣的，有的貼壁牢固，有的貼壁沒有那么牢固的，所以，讓所有的細胞消化同樣的時間對細胞是不公平的，他們受到了差別待遇當然會有脾氣啊。。。呵呵。大家爭取爭取做到因材施教，比如試試下面的“四步消化法”。（以難消化細胞為例）

這個沒有經過大規模驗證。對于用DMEM培養基培養的細胞，你在洗的時候如果是用無血清1640去洗細胞在隨即后的幾次中會比用DMEM洗的長的要好。同樣，用1640培養的也有這個現象。

如果不嫌麻煩的話，可以用PBS來洗，洗的效果和用無血清培養基洗的效果基本上是一樣的，對于有些細胞會更勝一籌。洗的目的主要是洗去培養瓶里殘留的血清，防止它對胰酶的影響。這樣能夠保證胰酶的消化能力優先，是很關鍵的一點。